Trong Thế chiến thứ hai, bà làm các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm ở nhà, nghiên cứu sự tăng trưởng của các sợi thần kinh trong phôi của gà. Việc này dẫn tới công trình nghiên cứu căn bản của bà sau này. Phòng thí nghiệm di truyền học đầu tiên của bà được đặt trong phòng ngủ ở nhà. Năm 1943, gia đình bà di chuyển xuống phía nam tới Firenza, và bà cũng lập phòng thí nghiệm tư ở đây. Năm 1945, gia đình quay trở lại Torino.

Tháng 9 năm 1946, Levi-Montalcini nhận một lời mời tới Đại học Washington tại St. Louis, dưới sự trông nom của giáo sư Viktor Hamburger. Mặc dù lời mời ban đầu chỉ là một học kỳ, nhưng bà đã ở lại đây 30 năm. Chính tại đây, bà đã làm công trình quan trọng nhất của mình: Từ các quan sát một số mô ung thư - loại mô gây ra tốc độ tăng trưởng tế bào thần kinh cực nhanh - bà đã cô lập nhân tố tăng trưởng thần kinh (NGF) trong năm 1952. Bà được cử làm giáo sư năm 1958, và năm 1962, bà lập một đơn vị nghiên cứu ở Roma, chia thời gian làm việc giữa Rome và St. Louis.

Từ năm 1961 tới năm 1969 bà lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu khoa Sinh học thần kinh (Neurobiology) tại "Hội đồng nghiên cứu quốc gia" (Consiglio Nazionale delle Ricerche, CNR) (Rome), và từ năm 1969 tới năm 1978 lãnh đạo Phòng thí nghiệm Sinh học tế bào.